一、HPLC全稱高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography),是一種快速的分離分析技術(shù)。HPLC具有高效、高速、高靈敏度、適用范圍廣和流動相選擇范圍廣等特點,因而發(fā)展迅速,并在醫(yī)藥、食品、化妝品和農(nóng)藥等很多行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。

二、HPLC峰形

HPLC分析過程中,由于各種原因,經(jīng)常會出現(xiàn)一些異常峰形,嚴(yán)重影響對結(jié)果的分析,給實驗人員帶來很大的困擾。下面介紹一些常見的峰形以及可能的原因:

1. 未出峰

可能的原因:

a. 未成功進(jìn)樣,或樣品未溶解進(jìn)溶劑中,或樣品分解變質(zhì)或樣品濃度太低;

b. 儀器本身的問題:泵或者檢測器故障;

c. 流動相選擇不合適,如對于反相硅膠柱來說,若流動相極性太大,是沖不下來一些小極性的物質(zhì)的,物質(zhì)一直保留在柱子中,因而不出峰。

d. 檢測器不合適,如:有些產(chǎn)品沒有紫外吸收或者吸收很弱,但是檢測還使用了UV檢測器2.平頭峰

可能的原因:

a. 樣品濃度過大或進(jìn)樣體積太大,這個也是大多數(shù)原因

b. 檢測器設(shè)置不正確

可能的原因:

a. 流動相吸收本底值過高

b. 進(jìn)樣過程中進(jìn)入空氣

c. 樣品組分的吸收低于流動相

d. 配制樣品的溶劑與流動相不一致4.肩峰

可能的原因:

a. 進(jìn)樣量過大;樣品濃度過高

b. 保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞

c. 保護(hù)拄或色譜柱污染或失效

d. 色譜柱柱頭塌陷

5.裂峰

可能的原因:

a. 溶劑效應(yīng):溶解樣品用的溶劑和起始流動相極性相差太大

b. 保護(hù)柱或色譜柱柱頭堵塞

c. 保護(hù)拄或色譜柱污染或失效

d. 色譜柱柱頭塌陷

6.鬼峰

鬼峰(ghost peak)是在某個譜圖里出現(xiàn),可能同樣的條件再做一次又不出現(xiàn)了,時有時無的峰。

可能的原因:

a. 進(jìn)樣閥殘余峰,在每次進(jìn)完樣后用充足的時間來平衡和清洗系統(tǒng)

b. 樣品中存在未知物,改進(jìn)樣品的預(yù)處理

c. 流動相污染,更換新流動相(或者換品牌);盡可能現(xiàn)配現(xiàn)用,隔夜的流動相再次使用時要過濾

d. 流路中有小的氣泡,打開Purge閥,加大流速排除7. 前伸峰

可能的原因:

a. 進(jìn)樣量或樣品濃度高

b. 溶解樣品的溶劑比流動相極性強

c. 保護(hù)拄或色譜柱污染或失效

d. 流動相不合適,更換新流動相(調(diào)pH或換種類、比例等)

8. 拖尾峰

可能的原因:

a. 進(jìn)樣量或樣品濃度高

b. 流動相不合適,更換新流動相(調(diào)pH或換種類、比例等)

c. 硅羥基作用:加入三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相pH值,鈍化樣品

d. 柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效:更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品

e. 色譜柱柱頭塌陷或柱效下降:更換色譜柱

注:除以上異常峰形外,HPLC檢測過程中,還有很多其它情況,小伙伴們可以從儀器本身、流動相、固定相(色譜柱)、柱溫和等度與梯度方法學(xué)等方面,調(diào)整參數(shù),最終找到一種最合適的HPLC方法。